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'fences' ein Zell-Migrations-Assay in 24-well-Zellkulturplatten

Einführung
Das hier vorgestellte Versuchssystem arbeitet mit wiederverwendbaren 16mm-Edelstahl- Silikon-Einsätzen ('fences') für 24-well-Zellkulturplatten. Die Einsätze erlauben den Zellen nur innerhalb eines umschriebenen Areals zu adhärieren. So steht bei Versuchsstart ein runder Zellrasen von definiertem Durchmesser zur Verfügung (Fischer et al. 1990, J.Immunol. Meth. 128: 235-239). Das Versuchssystem wurde ursprünglich entworfen, um die Expansion von Endothelzell-Monolayern zu untersuchen. Es eignet sich wohl nicht für Granulozyten. Durch relativ geringen Zell-, Raum- und Zeitaufwand ermöglicht es gleichzeitig viele Ansätze. Das System wird weltweit eingesetzt, um die Monolayerexpansion (Migration und/oder Proliferation) unter dem Einfluss von körpereigenen Substanzen und Pharmaka und/oder auf definierten Oberflächen zu untersuchen.

Das System wurde u.a. eingesetzt um HUVEC, Fibroblasten, Glatte Muskelzellen (SMC) und endotheliale Stammzellen (EPC) zu untersuchen. Für die Versuche lassen sich 24-well-­Zellkulturplatten der meisten Hersteller verwenden. (Eine Version für 48-well-Platten hat sich nicht durchgesetzt.)

Fences aus Stahl und Silikon
'Fences' aus Edelstahl und 'implantierbarem' Silikon.

Vorteile
Ähnliche Versuchssysteme mit allerdings großen Ringen wurden von Pratt et al.(1984, Am.J.Path. 117:349-354) und von Hasson et al.(1986, Surgery 100:384-391) vorgestellt. Probleme ergaben sich hier durch Verletzung der Monolayer beim Entfernen der Ringe sowie bezüglich der Sterilität. Der Platzbedarf limitierte eine intensive Nutzung. Diese Nachteile werden hier durch Reduktion der Ringdurchmesser, Gebrauch anderer Materialien und den Einsatz von 24-well-Platten überwunden. Auch werden die Oberflächenprobleme umgangen, wie sie bei der 'wounded layer'-Technik auftreten. Wissenschaftlich nicht vergleichbar sind Systeme wie der 'under-agarose assay' oder die Bøyden-Kammer.

humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC) nach 4 Tagen

humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC) nach 4 Tagen
auf Gelatine-beschichteten runden 15mm-Glasdeckgläsern in 24-well-Platten

links = unstimulierte HUVEC nach 4 Tagen,

rechts = HUVEC nach 4 Tagen stimuliert mit
25 µg/ml ECGF und 90 µg/ml Heparin.

Methodik
Die wiederverwendbaren 'fences' müssen vor jedem Versuch gereinigt und sterilisiert werden. Wenn sie nicht im Einsatz sind, sollten die Fences 'up-site-down', also auf dem Metallteil stehend, aufbewahrt werden, um das Silikon zu schonen. Zur Reinigung kann ein Labordetergent, Ethanol und kurzzeitig (1-2 min) ein Ultraschallbad eingesetzt werden. Die Sterilisation erfolgt am besten bei 121°C (2 atm, feucht); zwar ist 180°C (1 atm, trocken) möglich, aber dem Silikon auf die Dauer weniger zuträglich. Silikon ist direkt nach der Sterilisation etwas klebrig; die Fences sollten daher erst rund 1h später für einen Versuch eingesetzt werden, um sie und ggf. eingesetzte Oberflächen-Beschichtungen zu schonen.

Für einen Versuch werden die Multiwell-Platten mit den Fences bestückt und für rund 30 min im Inkubator auf 37°C vorgewärmt, auch um die Haftung des Silikons an der Oberfläche zu gewährleisten.

Für den Expansionsversuch werden in die zentralen Bohrungen eines jeden 16mm-Fence je 150 µl Medium mit z.B. je 30.000 HUVEC gegeben. Außerdem wird sicherheitshalber je 650 µl Medium ohne Zellen in die äußeren Kammern gefüllt, um ein Flüssigkeitsgefälle zwischen den beiden Kammern zu verringern. Im 'wound closure'-Versuch werden umgekehrt z.B. 130.000 HUVEC in 650 µl Medium in die äußere Kammer und 150 µl Medium ohne Zellen in die zentrale Kammer gefüllt. Entsprechend lassen sich Versuche zur Zellinteraktion planen mit verschiedenen Zellen innen und außen. Um Luftblasen zu vermeiden, ist es nötig, die Pipettenspitze tief in die jeweilige Bohrung einzuführen (2 mm Abstand zum Boden).

HUVEC brauchen 4-5 Stunden Zeit im Inkubator, um an den Untergrund anzuhaften (andere Zelltypen zum Teil etwas länger - aber nicht über Tage, da sonst freigesetzte Metallionen das Zellverhalten beeinflussen). Nach dieser Phase werden die Fences mit einer Pinzette entfernt und jedes Well wird zweimal vorsichtig gespült. Dann wird 1 ml Medium mit den jeweils zu untersuchenden Substanzen eingefüllt. Die Ansätze sollten als Dreifach- oder Vierfach-­Ansätze erfolgen.

Um zwischen Proliferation und Migration zu unterscheiden, können die Zellen direkt nach Versuchsansatz mit 15-25 Gy (1500-2500 rad) bestrahlt werden, oder es kann den Ansätzen ein Toxin (z.B. 10-20 µg/ml 5-Fluorouracil; laut Literatur bis zu 100 µg/ml) zugesetzt werden, um eine Proliferation zu unterbinden.

Der Durchmesser des Zellrasens beträgt beim Versuchsstart rund 6,7 mm, was einer Fläche von 35 mm2 entspricht. Nach einer Inkubation von z.B. 5-7 Tagen (bei HUVEC) mit regelmäßigem Mediumwechsel (z.B. alle zwei Tage) hat sich der Zellrasen erweitert. Der Versuch wird nun beendet, indem die Zellen fixiert werden (z.B. mit einem Ethanol:Methanol (1:1)-Gemisch oder mit z.B. 5-10%-iger Paraformaldehyd- in-Puffer-Lösung für 3-10 min). Nach einem Spülgang werden die Zellen gefärbt (z.B. mit 10%-iger Giemsa-Lösung für 20 min, gefolgt von einem Ethanol-Spülung für max. 1 min). Die von den Zellen eingenommene Fläche kann nun visuell vermessen werden z.B. mit Hilfe eines mm-Rasters (auf Folie kopiertes mm-Papier) oder mit dem Raster des Okulars. Deutlich bequemer ist ein Computer-Video-System, das die Fläche bzw. den Durchmesser ermittelt.

Bestandteile der Fences

Bestandteile :

a = Stahl (Funktion: Gewicht)

b = Silikon (Funktion: Begrenzung)

c = Rinne (Funktion: Zugang zur äußeren Kammer
und leichte Greifbarkeit der Fences mit der Pinzette)

Anmerkungen :   Nach einer Weile verfärbt sich Silikon leicht beige. Dieser Alterungsprozess beeinflusst allerdings kaum die Materialeigenschaften. Sollten sich die Silikonteile eines (fernen) Tages vom Stahl lösen oder unrettbar undicht werden, so sollten sie nicht weiter benutzt werden. Bitte bewahren Sie die Metallteile auf, wir können daran neue Silikonteile polymerisieren.

Sie sollten nicht erwägen, Zellen über mehrere Tage in den Fences zu kultivieren. Die Konzentration der Ionen, die aus den Metallteilen der Fences herausgelöst werden, könnte einen Wert erreichen, der das Verhalten der Zellen beeinflusst.

Ich denke, Sie werden mit dem Assay schnell zurechtkommen. Fragen Sie zurück, falls wir Ihnen helfen können. Bitte lassen Sie uns wissen, wenn dieser Text korrigiert oder ergänzt werden sollte.


Angebot
Sie können von uns zu Forschungszwecken einen Migrations-Assay-Kit (ein Set von 24 fences) zum einem Preis von € 440.oo (EURO) beziehen, Preis zuzügl. MWSt. (aber einschl. Fracht).
  Telefon : +49 241 4500 358


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